去美國看病 雙重標記探針的外切酶有活性

經研究發現，探針設計有兩個廣泛應用的熒光策略，非特異性和特異性針對目的DNA序列的熒光。非特異性染料是使用嵌入式的、能結合到dsDNA凹槽上的染料，如SYBR green或溴化乙錠。這是經濟且快速的定量擴增的方法，因為每次PCR循環后熒光都會累積。去美國看病服務機構愛諾美康介紹到，然而，因為染料是非特異性的，所以其他雙鏈序列，比如引物二聚體也會被檢測到。

特異性檢測方法應用了用熒光標記的、針對擴增子的寡核苷酸探針。探針與目的DNA區域互補，有一個熒光團（帶或不帶淬滅基團），可以吸收和發射能夠被熱循環儀探測到的特定波長的光。去美國看病在PCR擴增的過程中，探針或者在結合到目的DNA上時，以特定的方向改變它們的發射波譜，或者產生與擴增子數量成比例的熒光信號。

廣泛使用的探針包括雜交探針、水解或TagMan探針、小溝槽鍵合（MGB）探針和分子信標探針。用到了兩個都被熒光標記的寡核苷酸探針（一個供體和一個報告熒光團）。這些探針與目的DNA上兩個相互接近的區域互補。這種方法依賴于熒光共振能量轉移（FRET）的物理性質，去美國看病后當兩個熒光團彼此靠近時，供體熒光團受熱循環儀的光源刺激，發射出波長在報告熒光團吸收范圍內的光。

在一個PCR循環中，退火階段結合的兩個探針，允許熒光共振能量轉移發生，報告熒光團吸收供體熒光團發射的光，并發射出可以由實時PCR熱循環儀，檢測到的波長的光。去美國看病每次循環的產物數量與產出的FRET熒光成正比，雜交探針對于小型缺失，或者插入突變的監測也很有用。

一個具有y外切酶活性的DNA聚合酶標記，在PCR開始時，因為淬滅劑染料吸收了報告熒光團發出的光，所以探針并不會發出熒光。去美國看病后，在每個循環的退火和延伸階段，探針結合到PCR產物中，同時具有外切酶活性的DNA聚合酶將探針酶切，并使報告熒光基閉和淬滅熒光基團分離。游離熒光的M與每個循環累積的PCR產物數M成正比。

去美國看病服務機構愛諾美康介紹到，MGB探針與水解探針有相似的工作原理，這個方法用到了一種雙重標記探針，并且需要有外切酶活性。不同之處是添加了一種可以結合到dsDNA小凹槽的共價分子，這可以進一步穩定探針與目的DNA的雜交，從而提高反應的解鏈溫度。

水解探針對于識別單核苷酸多態性很有效，針對感興趣的等位基因設計一個特異性的探針。完美的匹配會使報告基團釋放，如有任何的不匹配，直到反應后也不會有一個報告基閉被釋放。去美國看病后MGB探針對較短的探針特別有用，因其具有小凹槽鍵合的固有穩定性。