出國治療 蛋白質(zhì)組分離大都采用凝膠方法

克利夫蘭診所的科和風(fēng)濕疾病中心為骨疾病、關(guān)節(jié)疾病和締結(jié)組織疾病的兒童和成人患者提供專業(yè)的診斷、治療和康復(fù)服務(wù)。該中心的組成部門包括骨科、風(fēng)濕和免疫疾病科、關(guān)節(jié)炎和肌骨骼疾病治療中心、矯正和假肢中心、肌骨骼疾病物理治療和康復(fù)中心、以及康復(fù)中心。該研究院的骨科和風(fēng)濕中心在年度美國各大醫(yī)院的專科排名中位居前三甲。

世界上第一例冠狀動脈造影、第一例冠狀動脈搭橋手術(shù)、第一例成功的咽喉移植手術(shù)、第一例近似全臉的移植手術(shù)都是由克利夫蘭診所完成的。出國治療機(jī)構(gòu)愛諾美康介紹到，在《美國新聞和世界報道》評定的“2012-13美國佳醫(yī)院”的排名中，克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心的骨科和風(fēng)濕疾病研究院在骨科專科領(lǐng)域排名第三，在風(fēng)濕病專科領(lǐng)域排名第二。

蛋白質(zhì)分離主要包括兩種典型的方法，它們都是一些常規(guī)技術(shù)的組合。第一種是利用高濃度的尿素緩沖液溶解蛋白，然后采用雙向凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。分離的蛋白可以采用考馬斯亮藍(lán)染色、銀染或熒光染色，以便于對目的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行深人分析。這些所謂的目的蛋白斑點(diǎn)主要是由差異蛋白質(zhì)組定義的，比如，在不同發(fā)育階段、分化水平、處理方式、年齡、細(xì)胞類型等的兩種或多種樣品中特異性表達(dá)或缺失的蛋白。

將目的蛋白斑點(diǎn)從凝膠中切下，并用胰酶消化；然后通過洗脫、提取與純化等步驟從凝膠中分離出純凈的目的多肽段。經(jīng)質(zhì)譜分析后得到目的肽段的序列數(shù)據(jù)，并將其與RNA/DNA和蛋白數(shù)據(jù)庫中的存儲，或模擬的胰酶消化的肽段序列做比對。若該肽段序列與數(shù)據(jù)庫中已知的序列的相似度達(dá)到某一閾值，就可以確定該肽段的氨基酸序列。

第二種蛋白質(zhì)分離的方法，同樣也是先將蛋白樣品置于高濃度的尿素緩沖液中溶解。不同之處在于，蛋白分離之前需先用胰酶消化。然后利用高效液相 色譜在酸性環(huán)境中，將混合多肽段按其所帶的電荷分成7~12份。每一份多肽段再根據(jù)其在不同極性的緩沖液中的疏水性進(jìn)行反相分離。這種分離方法可使得當(dāng)時洗脫下的多肽直接進(jìn)人與HPLC串聯(lián)的質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，疏水性多肽通常后被洗脫分析。此外，早在質(zhì)譜儀應(yīng)用之前，HPLC就已廣泛用于目標(biāo)蛋白的富集分析。與第一種方法相同，質(zhì)譜儀測到的肽段序列與生物信息數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定所測肽段的歸屬信息。

出國治療機(jī)構(gòu)愛諾美康介紹到，傳統(tǒng)上，幾乎所有的蛋白質(zhì)組分析，都采用基于凝膠的方法來分離完整的或消化后的蛋白。這主要是因為凝膠分離技術(shù)重復(fù)性好，可靈敏檢測明確的蛋白質(zhì)分離。高分辨率的雙向電泳包括等電聚焦，和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳兩個分離步驟。IEF根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電量的不同進(jìn)行分離，能檢測不同的多肽和蛋白以及同種蛋白的不同電荷異構(gòu)體。

因此，利用ffiF可解析蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。用于分離蛋白的pH梯度有兩種形式：液相pH梯度和固相pH梯度。在液相PH梯度中，蛋白樣品被置于裝有不同的兩性電解質(zhì)緩沖液和SDS-PAGE膠的玻璃管中。