海外醫療 蛋白質在變溫情況下仍然有用

一般來說，新鮮組織用蛋A酶K消化，可以得到產量大質量又高的DNA。但是，這個過程相當費力，其中涉及多個酚氯仿提取步驟。海外醫療服務機構愛諾美康介紹到，另一種替代的、更快的提取方法是，將新鮮組織在無菌水中煮沸15分鐘，但這種方法得到的DNA產量和質量均較低。

通過上面描述的任何一種方法，均可以從歸檔樣本、染色切片或細胞制劑中成功提取DNA。在提取DNA時，應避免使用含有EDTA的緩沖液，因為它會影響Mg2+濃度。此外，海外醫療過程中，應避免有機溶劑的污染，因為它會影響其他的PCR試劑。dNTP可以通過冷凍干燥或中和水溶液的方法獲得，它們也可以作為標記核苷酸（放射性或熒光標記），以用于后續的雜交和測序反應。

目前，海外醫療領域通常由專門生產PCR試劑的制造商，以儲存液的形式提供，后的工作液濃度是50~200M，足夠合成6.5~25lxg的DNA。PCR緩沖液大多數選擇濃度為10mM、pH值為8.5或9.0、溫度在25°C的Tris緩沖液。海外醫療過程中，Tris緩沖液的pH 值與溫度相關，比如溫度為25°C時，緩沖液pH值為8.8，溫度為72°C時，pH值為7.4，這是Taq聚合酶的佳工作溫度和pH值。

海外醫療服務機構愛諾美康介紹到，50mM氯化鉀和氣化鈉會促進引物退火，而濃度過大會抑制Taq聚合酶的活性。通常不使用磷酸鹽，因為它會在PCR溫度升髙時 沉淀。反應緩沖液的另一個關鍵因素,是特定濃度的Mg2+，每次擴增反應需根據經驗確定其濃度。同時，添加劑可用于進一步優化PCR擴增，大多數反應緩沖液由制造商以10x濃度捆綁提供，附帶或不帶Mg2+和添加劑。

DNA聚合酶徹底改變PCR的關鍵試劑，是在極端環境中生存的微生物中，發現的耐熱DNA聚合酶。海外醫療服務時，大多數蛋白質在DNA的變性溫度下會變性，而這種聚合酶仍然可以起作用。3種常用的DNA聚合酶是：Pfu（強烈火球菌）、Vent或Tli（嗜熱高溫球菌）和Taq（棲熱水生菌）聚合酶，后一個是常見的商品化使用的聚合酶。這些聚合酶功能很強大，只要給出引物模板雜交物，它們就能在很大的溫度范圍內擴增DNA。

然而，這些酶類的佳工作溫度是70°C，pH值是7.0~7.5，聚合酶活動的半衰期在92.5°C時大于2小時，在95°C時為40分鐘，在97.5°C時為5分鐘，這也是海外醫療后，反應超過25個循環時保真度下降，和出現平臺效應的原因。