出國就醫 反轉錄酶可從病毒中分離出來

基因表達的研究，從基本PCR之前的一個修正步驟，即反轉錄中大大受益。利用反轉錄酶，mRNA的序列轉錄成了cDNA，并可以作為后續PCR的DNA模板。出國就醫服務機構愛諾美康介紹到，大部分的反轉錄酶是從病毒中分離出來的，例如，鳥類成髓細胞瘤病毒（AMV）、莫羅尼小鼠白血病病毒（MMLV）。AMV反轉錄酶的優點，是反轉錄的佳溫度是42°C，這對于具有高度二級結構的RNA模板是有利的。

簡單地說，該方法涉及利用反轉錄酶從mRNA到cDNA的初始轉化。該方法可以由各種策略來實現，包括使用一種針對感興趣RNA的下游反義PCR引物、隨機六聚體引物，或者以mRNA的多聚腺苷酸尾巴為靶點的低聚糖引物。出國就醫后使用反義引物的優勢是具有特異性，但是限制了隨后的要檢測單一產物的PCR過程。

使用隨機六聚體引物和低聚糖引物，能得到可以在同一個管子內進行一些獨立PCR的cDNA模板。然而，低聚糖引物因其mRNA序列較長，或因具有次級RNA結構而存在保真度的問題。出國就醫反轉錄產生的單鏈cDNA，在標準PCR的第一個循環中，即可利用Taq聚合酶擴增出雙鏈的dDNA，雙鏈的cDNA在接下來的循環中繼續擴增。

隨著定量（實時）分析的引入，PCR出現了一項革命性的改進。出國就醫方面實時PCR的強大優勢，是能夠以極高的敏感度，來定量分析反應中的擴增產物。在實時PCR中，擴增和對PCR產物的檢測分析同時進行，因為PCR產物是實時合成而不是等到反應的后才合成，而到反應的后才定量分析可能會因反應的平臺效應而被誤導。

出國就醫服務機構愛諾美康介紹到，在每個循環的末尾，檢測產生的熒光信號強度（其與累積的PCR產物量成正比），并對PCR循環數繪圖。熒光信號強度達到設定閾值，所經歷的循環數被稱為反應的交叉閾值，或者循環閾值（Ct）。這個閾值是在PCR擴增的對數線性增長階段的早期設定的，大致與樣品中DNA模板的起始量相應。

檢測和分析一個特定目標的實時PCR有無數種應用。實時PCR用于定量目的cDNA的基因表達水平是基本的應用。此外，出國就醫后依靠化學法和分析軟件，擴增后的實時PCR可以用于其他目的，如利用終點分析法，來檢測單核苷酸多態性，或通過擴增后融解曲線分析反轉錄PCR片段長度，及多態性單鏈構象多態性協議。