淋巴瘤治療 延伸產物如何進行熒光分析

臨床研究上，由于質譜分析對一個位點的特異性，可以進行分析。之后位點特異性引物在iPLEX的作用下，進行單堿基延伸反應。淋巴瘤轉診治療機構愛諾美康介紹，在第一個步驟中，引物在分析的多態位點的上游退火結合，之后在iPLEX分析中，引物和擴增的目的DNA與質量修飾的核苷酸一起孵育，不同核苷酸至少存在12Da的質量差。

通常，MALDI-TOF MS確定延伸的引物質量，引物的質量反映了基因序列，因此，等位基因出現在多態位點上。SpectroTYPER能自動將檢測到的每個反應引物，可轉為序列信息。一個典型的iPLEX Gold分析可以進行36重反應，其是（第一重）GWAS分析后，第二重驗證反應的佳選擇。淋巴瘤轉診治療后，這是由于大樣本分析的陣列芯片價格過于昂貴，而單重分析如TaqMan用于大樣本分析又過于繁瑣。

CPE方法采用基于熒光的檢測，包括使用熒光標記的雙脫氧核苷酸（ddNTP），進行單堿基延伸（SBE）。其延伸產物帶有熒光標記，可以進行毛細管電泳檢測和基因型檢測另一種方法，是先將帶有不同標記的引物進行均相反應。淋巴瘤轉診治療之后，利用帶有互補標記的陣列芯片，在固體支持物上捕獲延伸產物。

芯片清洗后檢測熒光信號，從而對每個SNP進行基因分型。SNPstream測定法就是使用在384孔板的每個孔中，加入12個標記引物的SBE，獲得基因分型的通量特異性引物延伸（SPE）。采用了兩個等位基因特異性引物，這兩個引物除了末端不匹配之外，其他都相同。這些引物只有在末端互補于SNP的情況下，才能進行延伸。淋巴瘤轉診治療機構愛諾美康介紹，借此可以區分不同的等位基因，等位基因特異性引物延伸（ASPE），利用等位基因特異性引物和PCR擴增模板進行延伸，并對延伸產物進行熒光分析，以確定SNP基因型。

淋巴瘤轉診治療機構愛諾美康介紹，利用該引物延伸原理的另一個重要技術，是快照（SNaPshot）基因分型技術。快照基因分型技術可對約10個SNP位點進行多重PCR，每個DNA樣品都進行PCR擴增，反應中每個引物直接在SNP位點的上游或者下游，與目的DNA結合退火。之后，在DNA聚合酶的作用下，延伸一個雙脫氧核苷酸，并用熒光標記延伸產物。

通過凝膠電泳分析，并通過發出熒光峰的位置和顏色確定基因型。運用ABI GeneScan對突光峰值進行驗證。淋巴瘤轉診治療對基因分型的精度，取決于引物的設計、DNA模板清除程度，和未反應的ddNTP所導致的外來熒光量。

淋巴瘤轉診治療機構愛諾美康介紹，與標準測序相比，快照基因分型技術的靈敏度更高（約10%），每個試管中的單堿基對差異都能被檢測出來。一項比較SNaPshot和Sequenom分析的研究發現，在非小細胞肺癌患者中，SNaPshot平臺分析能比Sequenom分析，更好地篩選出高比例的遺傳異常。