肺癌治療 測序引物如何與模板互補

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，PSQ是一種可靠的定量測序合成方法，可以用于確定一個SNP基因型，也可以用于篩選突變、甲基化分析和病毒細(xì)菌DNA分型。肺癌轉(zhuǎn)診治療機構(gòu)愛諾美康介紹，相對于其他SNP基因分型方法，只要模板的質(zhì)量好，PSQ還可以對SNP附近的50~100個堿基序列，進行測序并評估其他的突變。如2、3和4個等位基因的SNP、插入或缺失和點突變。

一個反應(yīng)中可以分析4~5個位置接近的SNP，1小時內(nèi)一個板多可以分析96個SNP。該測定法是通過檢測PCR反應(yīng)，互補成實時焦磷酸（PPi）的釋放而進行分析。肺癌轉(zhuǎn)診治療后，用于PCR合成的三個引物由PSQ檢測設(shè)計軟件設(shè)計，可以擴增SNP附近一個100~200bp的DINA序列。其中一條引物的末端被生物素化，以便將PCR產(chǎn)物的一條單鏈作為PSQ反應(yīng)的模板。

肺癌轉(zhuǎn)診治療機構(gòu)愛諾美康介紹，測序引物與PSQ模板互補，退火后其末端位于SNP旁或者SNP上游幾個堿基。將此測序引物與生物素標(biāo)記的單鏈DNA（ssD-NA）模板雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶混合。這4種dNTP，分別循環(huán)反復(fù)地輪流加入反應(yīng)體系。開始進行的是聚合反應(yīng)，即摻入核苷酸并釋放出與摻入的核苷酸等摩爾的PPi。釋放出的PPi在ATP硫酸化酶的作用下與腺苷磷酸（APS）反應(yīng)產(chǎn)生ATP。

進一步驅(qū)動熒光素酶，介導(dǎo)熒光素氧化反應(yīng)，同時產(chǎn)生與ATPM成比例的熒光，用電荷耦合器件（CCD）照相機或光電倍增管拍攝突光，并由專用軟件自動分析將pyrogram轉(zhuǎn)換成核苷酸序列。然而，肺癌轉(zhuǎn)診治療后，如果DNA濃度很低，則會產(chǎn)生近似噪聲水平的熒光峰值信號，這會導(dǎo)致不正確的核苷酸分析結(jié)果。

MAS信號，通常需要同時使用多種引物，進行復(fù)合焦磷酸測序鑒定。這會產(chǎn)生重疊的引物特異性焦磷酸測序信號，與焦磷酸測序相比，肺癌轉(zhuǎn)診治療的這一技術(shù)，能將SAS測序信號轉(zhuǎn)換成正確的單鏈序列，也能將MAS信號轉(zhuǎn)換成與焦磷酸測序軟件相應(yīng)的正確序列。這一測序方法，并不能滿足標(biāo)準(zhǔn)測序的需求，因為它檢測SNP時讀取的長度很短。

兩個等位基因特異性引物，都覆蓋SNP位點。但是，每一對引物都只與SNP的一個突變序列完全匹配。肺癌轉(zhuǎn)診治療后，只有當(dāng)特異的SNP序列存在時，才會產(chǎn)生相應(yīng)的產(chǎn)物。不同PCR產(chǎn)物的長度差別很大，不難用凝膠電泳區(qū)分。通過T-ARMS-PCR檢測一個反應(yīng)中6個SNP的技術(shù)，近被開發(fā)出來并且已經(jīng)用于臨床。